Podle současných zpráv se James několik měsíců před svou smrtí necítil dobře, trpěl různými příznaky včetně bolesti na hrudi, dušnosti a zažívacích problémů. Zažil také období nevyzpytatelného chování a deprese. 21. března 1625 utrpěl James těžkou mozkovou mrtvici, po níž ochrnul na levou stranu těla. Nebyl schopen mluvit ani se hýbat a jeho stav se rychle zhoršoval.
James zemřel o šest dní později, obklopen svou rodinou a poradci. Byl pohřben ve Westminsterském opatství 5. dubna 1625. Jeho syn Karel I. po něm nastoupil na trůn.
Zatímco přesná příčina smrti není známa, předpokládá se, že k Jamesově smrti přispěla kombinace faktorů, včetně jeho zhoršujícího se zdraví, mrtvice a terciánské ague. Některé současné zprávy také naznačují, že James mohl být otráven, ale neexistuje žádný konkrétní důkaz, který by toto tvrzení podpořil.